Penicillamina
C5H11NO2S 149.21
d-Valina, 3-mercapto-.
d-3-Mercaptovalina [52-67-5].
» La penicillamina contiene non meno del 97,0% e non più del 102,0% di C5H11NO2S, calcolato su base essiccata.
Imballaggio e stoccaggio- Conservare in contenitori stretti.
Norme di riferimento USP<11>-
Penicillamina USP RS
USP Penicillina G Potassio RS
Disolfuro di penicillamina USP RS
C10H20N2O4S2
Identificazione-
A: Assorbimento degli infrarossi <197M> (50 mg in 300 mg).
B: Sciogliere 10 mg in 5 mL di acqua e aggiungere 1 goccia di idrossido di sodio 5 N e 20 mg di ninidrina: viene prodotto immediatamente un colore blu o viola-blu.
C: Sciogliere 20 mg in 4 mL di acqua, aggiungere 2 mL di soluzione di acido fosfotungstico (1 su 10) e scaldare quasi fino all'ebollizione: si produce immediatamente un colore blu intenso.
Rotazione specifica<781S>: tra 60,5 e 64,5.
Soluzione test: 50 mg per ml, in idrossido di sodio 1,0 N.
pH<791>: tra 4,5 e 5,5, in una soluzione (1 su 100).
Perdita all'essiccazione<731>- Essiccare circa 100 mg, accuratamente pesati, in una bottiglia con tappo capillare sotto vuoto ad una pressione non superiore a 5 mm di mercurio a 60 per 3 ore: perde non più dello 0,5% del suo peso.
Residuo alla combustione<281>: non più dello 0,1%, il residuo carbonizzato viene inumidito con 2 ml di acido nitrico e 5 gocce di acido solforico.
Metalli pesanti, Metodo II<231>: non più dello 0,002%.
Limite dell'attività della penicillina-
Tampone pH 2,5- Sciogliere 100 g di fosfato di potassio monobasico in acqua, aggiungere 0,2 mL di acido cloridrico, diluire con acqua a 1000 mL e mescolare. Se necessario, regolare con acido fosforico o con idrossido di potassio 10 N fino a pH 2,5.
Preparazione standard- Preparare come indicato per la penicillina G nella Tabella 1 in Antibiotici-Saggi microbici 81, tranne per preparare una soluzione madre finale contenente 100 unità di penicillina G per ml e sei diluizioni di prova che vanno da 0,005 unità di penicillina G per ml a 0,2 unità di penicillina G per ml e per utilizzare una dose mediana dello standard di 0,050 unità di penicillina G per ml.
Preparazione al test- Sciogliere 1,0 g in acqua per ottenere 18,0 mL, trasferire 9,0 mL di questa soluzione in un separatore, aggiungere 20 mL di acetato di amile e 1 mL di tampone pH 2,5 e agitare. Lasciare separare gli strati e aspirare lo strato acquoso in un secondo separatore, conservando l'estratto di acetato di amile nel primo separatore. Controllare il pH dello strato acquoso e, se è superiore a 3,0, regolarlo con acido cloridrico a pH 2,5 ed estrarre con 20 mL di acetato di amile. Eliminare lo strato acquoso e aggiungere l'estratto di acetato di amile al primo separatore. Lavare gli estratti combinati di acetato di amile con 10 mL di tampone pH 2,5 diluito (1 su 10) ed eliminare lo strato acquoso. Estrarre l'acetato di amile con 10,0 mL di tampone n. 1 (vedere Tamponi fosfato e altre soluzioni nella sezione Terreni e diluenti in Antibiotici—Saggi microbici 81). Utilizzare una porzione dell'estratto tampone come soluzione test A. A una porzione da 5-ml dell'estratto aggiungere 0,1 ml di soluzione di penicillinasi e incubare a 36-37,5 per 60 minuti (soluzione test B).
Preparazione dell'inoculo- Preparare come indicato in Antibiotici-Saggi microbici 81, utilizzando Micrococcus luteus (ATCC 9341) come organismo di prova e un inoculo che dia zone di inibizione chiare e nette di diametro compreso tra 17 mm e 21 mm con il livello di dose mediano dello standard.
Procedura- Procedere come indicato per il metodo cilindro-piastra in Antibiotici-Saggi microbici 81, utilizzando 10 ml di terreno 1 per lo strato di base e 4 ml di terreno 4 inoculato per lo strato seme e incubando le piastre da 29 a 31, tranne che su ciascuna piastra di prova per riempire 2 cilindri con la soluzione di prova A, 2 cilindri con la soluzione di prova B e 2 cilindri con la dose mediana dello standard. Se la soluzione del test A non presenta zone di inibizione, il test è negativo per la penicillina. Se la soluzione test A produce una zona di inibizione e la soluzione test B no, è presente penicillina. Determinare il suo livello dalla curva standard: non più di 0,01 unità di penicillina G si trovano in ogni ml di soluzione test A (0,2 unità di penicillina G per g).
Mercurio-
[nota-Il ditizonato mercurico è -sensibile alla luce. Esegui questo test in condizioni di luce attenuata.]
Soluzione madre di ditizone- Sciogliere 40 mg di ditizone in 1000 ml di cloroformio.
Titolante ditizone- Diluire 30,0 ml di soluzione madre di ditizone con cloroformio a 100,0 ml. Questa soluzione contiene circa 12 mg di ditizone per L.
Soluzione standard- Trasferire 135,4 mg di cloruro mercurico in un matraccio tarato da 100-mL, aggiungere acido solforico 0,25 N al volume e mescolare. Questa soluzione contiene l'equivalente di 100 mg di Hg in 100 ml.
Soluzione standard diluita- Pipettare 2 mL di soluzione standard in un matraccio tarato da 100-mL, aggiungere acido solforico 0,25 N al volume e mescolare. Ogni ml di questa soluzione contiene l'equivalente di 20 µg di Hg.
Standardizzazione- Pipettare 1 ml di soluzione standard diluita in un separatore da 250-ml e aggiungere 100 ml di acido solforico 0,25 N, 90 ml di acqua e 10 ml di soluzione di idrossilammina cloridrato (1 su 5). Quindi aggiungere 1 mL di soluzione disodica edetata (1 su 50), 1 mL di acido acetico glaciale e 5 mL di cloroformio, agitare per 1 minuto, lasciare separare ed eliminare lo strato di cloroformio. Alla soluzione aggiungere il titolante Dithizone, in porzioni da 0,3 mL a 0,5 mL, da una buretta da 10-mL. Dopo ogni aggiunta, agitare la miscela 20 volte e consentire allo strato di cloroformio di separarsi ed eliminarlo. Continuare fino a quando l'aggiunta di Dithizone titolante rimane verde dopo l'agitazione. Calcolare la quantità, in µg, di mercurio equivalente a 1 mL di Ditizone titolante dividendo 20 per il numero di mL di Ditizone titolante aggiunti.
Procedura- Trasferire 500 mg di penicillamina in un pallone Kjeldahl da 650-mL contenente alcune perle di vetro, inclinare il pallone con un angolo di circa 45, e aggiungere 2,5 mL di acido nitrico attraverso un piccolo imbuto posto nell'imboccatura del pallone. Lasciare riposare la miscela a temperatura ambiente finché non si sviluppano i fumi del protossido di azoto e la reazione vigorosa si placa (da 5 a 30 minuti). Aggiungere attraverso l'imbuto 2,5 mL di acido solforico, e scaldare, prima dolcemente e poi fino alla produzione di fumi di anidride solforosa, quindi raffreddare. Aggiungere con cautela 2,5 mL di acido nitrico, riscaldare nuovamente fino alla produzione di fumi di anidride solforosa e raffreddare. Ripetere il trattamento con acido nitrico e scaldare, quindi raffreddare e aggiungere con cautela 50 ml di acqua, sciacquando l'imbuto e raccogliendo le acque di risciacquo nel pallone. Rimuovere l'imbuto, far bollire la soluzione fino a circa la metà del suo volume (circa 25 ml) e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Trasferire in un separatore da 250-mL con l'aiuto di acqua e aggiungere acqua per ottenere circa 50 mL. Aggiungere 1 mL di soluzione disodica edetata (1 su 50) e 1 mL di acido acetico glaciale ed estrarre con piccole porzioni di cloroformio finché l'ultimo estratto cloroformio rimane incolore. Eliminare l'estratto in cloroformio e aggiungere 50 ml di acido solforico 0,25 N, 90 ml di acqua e 10 ml di soluzione di cloridrato di idrossilammina (1 su 5). Aggiungere il titolante Dithizone, in porzioni da 0,3 mL a 0,5 mL, da una buretta da 10-mL. Dopo ogni aggiunta, agitare la miscela 20 volte e consentire allo strato di cloroformio di separarsi ed eliminarlo. Continuare fino a quando l'aggiunta di Dithizone titolante rimane verde dopo l'agitazione. Calcolare la quantità di mercurio presente: il limite è 10 µg (0,002%).
Limite del disolfuro di penicillamina-
Diluente, fase mobile e soluzione risolutiva-Preparare come indicato nel dosaggio.
Preparazione standard- Sciogliere una quantità accuratamente pesata di penicillamina disolfuro RS USP nel diluente per ottenere una soluzione avente una concentrazione nota di circa 0,025 mg per ml.
Preparazione al test- Utilizzare la preparazione del test.
Sistema cromatografico- Procedere come indicato nel dosaggio. Cromatografare la preparazione dello standard e registrare le risposte del picco del disolfuro di penicillamina come indicato nella procedura: la deviazione standard relativa per le iniezioni replicate non è superiore al 2,0%.
Procedura- [nota-Utilizzare le aree dei picchi in cui sono indicate le risposte dei picchi.] Iniettare separatamente volumi uguali (circa 20 µl) della preparazione standard e della preparazione test nel cromatografo, registrare i cromatogrammi e misurare le risposte per i picchi del disolfuro di penicillamina. Calcolare la percentuale di disolfuro di penicillamina (C10H20N2O4S2) nella penicillamina presa dalla formula:
100(CS / CU)(rU / rS)
in cui CS è la concentrazione, in mg per ml, di disolfuro di penicillamina USP RS nella preparazione standard, CU è la concentrazione, in mg per ml, di penicillamina nella preparazione test e rU e rS sono le risposte di picco del disolfuro di penicillamina ottenute rispettivamente dalla preparazione test e dalla preparazione standard: non si trova più dell'1,0% di disolfuro di penicillamina.
Analisi-
Diluente- Sciogliere 1,0 g di disodio edetato in acqua per ottenere 1000 mL di soluzione.
Fase mobile- Sciogliere 6,9 ​​g di fosfato di sodio monobasico e 0,20 g di 1-esansolfonato di sodio in acqua per ottenere 1000 mL di soluzione. Regolare con acido fosforico ad un pH di 3,0 ± 0,1 e filtrare attraverso un filtro adatto con porosità di 1 µm o più fine. Se necessario, apportare le modifiche (vedere Idoneità del sistema in Cromatografia<621>).
Soluzione di risoluzione- Preparare una soluzione nel diluente contenente circa 1 mg di penicillamina RS USP e 0,1 mg di penicillamina disolfuro RS USP per ml.
Preparazione standard- Sciogliere una quantità accuratamente pesata di penicillamina RS USP nel diluente per ottenere una soluzione avente una concentrazione di circa 1,25 mg per ml.
Preparazione del test- Trasferire circa 125 mg di penicillamina, accuratamente pesati, in un matraccio tarato da 100 ml, sciogliervi e diluire con il diluente a volume, quindi mescolare.
Sistema cromatografico (vedi Cromatografia<621>)-Il cromatografo liquido è dotato di un rilevatore da 210-nm e di una colonna da 3,9-mm × 30-cm contenente l'impaccamento L1. La portata è di circa 1,6 ml al minuto. Cromatografare la soluzione di risoluzione e registrare le risposte come indicato per la procedura: i tempi di ritenzione relativi sono circa 0,7 per la penicillamina e 1,0 per il disolfuro di penicillamina e la risoluzione, R, tra il picco della penicillamina e il picco del disolfuro di penicillamina non è inferiore a 3,0. Cromatografare la preparazione dello standard e registrare le risposte come indicato per la procedura: la deviazione standard relativa per le iniezioni replicate non è superiore all'1,0%.
Procedura- [nota-Utilizzare le aree di picco in cui sono indicate le risposte di picco. ] Iniettare separatamente volumi uguali (circa 20 µL) della preparazione dello standard e della preparazione del dosaggio nel cromatografo, registrare i cromatogrammi e misurare le risposte per i picchi principali. Calcolare la quantità, in mg, di penicillamina (C5H11NO2S) nella porzione di penicillamina presa con la formula:
100°C(rU/rS)
in cui C è la concentrazione, in mg per mL, di penicillamina RS USP nella preparazione dello standard, e rU e rS sono le risposte di picco della penicillamina ottenute rispettivamente dalla preparazione del test e dalla preparazione dello standard.